Fosfat terdapat dalam air alam atau air limbah sebagai senyawa ortofosfat, polifosfat dan fosfat organis. Setiap senyawa fosfat tersebut terdapat dalam bentuk terlarut, tersuspensi atau terikat di dalam sel organisme dalam air. orthophosphate adalah phosphate anorganik, merupakan salah satu bentuk phosphor (P) yang terlarut dalam air. Orthophospate adalah benttuk phosphor yang dapat langsung dimanfaatkan oleh organism nabati (fitoplankton dan tumbuhan air).
Dalam larutan asam, orthophosphate bereaksi dengan Ammonium molybdate membentuk senyawa kompleks Ammonium phosphomolybdate. Dengan suatu pereaksi reduksi (Metode Stannous chloride), molybdenum dalam senyawa kompleks tersebut dapat tereduksi menjadi senyawa yang berwarna biru. Intensitas warna biru bertambah dengan semakin besarnya kadar fosfat terlarut yang ada. Banyaknya konsentrasi ortofosfat dalam air contoh dapat terukur dengan menggunakan prinsip spektrofotomerik yang dilakukan di labortorium.
Agar dapat terbaca oleh mesin spektrofotometer, ortofosfat dalam 10 ml air contoh yang telah disaring harus direaksikan terlebih dahulu dengan beberapa senyawa kimia. Akan tetapi reaksi ini harus berjalan dibawah pH 8.3. Oleh karena itu, air contoh diberikan 1 atau 2 tetes indikator phenolphthalein sebagai penunjuk pH. Bila muncul warna merah muda setelah diberi indicator (artinya pH>8.5), maka pH air contoh diturunkan dengan cara menambahkan H2SO4 encer sampai warnanya berubah menjadi bening (pH<8.3).
Setelah itu air contoh tersebut direaksikan dengan 1.6 ml combine reagent yang terdiri atas H2SO4 5 N, potasium antimonil tartat, amonium molibdat, dan asam askorbat. Kemudian ditutup rapat dan didiamkan selama 10 menit. Lalu absorbansi warna air contoh (biru) diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 880 nm. Warna biru yang ditimbulkan merupakan akibat terbentuknya senyawa amonium fosfomolibdat tereduksi. Kemudian Absorbansi air contoh disesuaikan dengan absorbansi akuades (blanko) dan konstanta perhitungan (APHA, 1989).
Cara Kerja :
a. Mengambil sampel air yang dengan menggunakan pipet 2,0 yang telah disaring, lalu memasukkan ke dalam tabung reaksi.
b. Menambahkan 2,0 ml H3BO3 1%, lalu mengaduknya.
c. Menambahkan 3,0 ml larutan pengoksid fosfat (campuran antara Asam sulfat 2,5 M, asam ascorbic & ammonium molybdate) lalu mengaduknya. Dan biarkan satu jam, agar terjadi reaksi yang sempurna.
d. Membuat larutan blanko dari 2,0 ml akuades. Dengan melakukan prosedur b dan c
e. Memilih program pengukuran fosfat pada alat spektrofotometer
f. Memasukkan ke dalam kuvet larutan blanko yang telah dibuat kemudian memasukkan kuvet ke alat Spektrofotometer kemudian menekan “Zero”
g. Setelah itu memasukkan kuvet yang berisi contoh air yang telah dipreparasi kemudian menekan “Read”
h. Mencatat nilai fosfat yang diperoleh dalam satuan mg/L
Gambar 33. Pengukuran kualitas air dengan menggunakan spektofotometer