(1) Persiapan dan homogenisasi contoh untuk uji Angka Lempeng Total dan Escherichia coli
Prinsip:
Pembebasan sel-sel bakteri yang mungkin terlindung oleh partikel makanan dan untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan dalam makanan. Persiapan dan homogenisasi contoh bertujuan agar bakteri terdistribusi dengan baik di dalam contoh makanan yang ditetapkan.
Peralatan:
(a) Alat homogenisasi yang sesuai (blender) dengan kecepatan putaran 10000 rpm sampai dengan 12000 rpm;
(b) Otoklaf
(c) Pemanas listrik;
(d) neRaca kapasitas 2000 g terkalibrasi dengan ketelitian 0,1 g;
(e) Labu ukur 1000 ml, 500 ml, dan 50 ml terkalibrasi;
(f) Gelas piala steril;
(g) Erlenmeyer steril;
(h) Botol pengencer steril;
(i) Pipet volumetrik steril; 10,0 mL dan 1,0 mL terkalibrasi, dilengkapi dengan bulb dan pipettos
(j) Tabung reaksi; dan
(k) Sendok, gunting, dan spatula steril.
Larutan pengencer:
Butterfield’s Phosphate-Buffered Dilution Water (BPB);
(a) KH2PO4 34 g
(b) Air suling 500 ml
Atur pH dengan NaOH sehingga pH 7,2, tepatkan volume sampai 1000 ml dengan air suling. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Simpan pada refrigerator untuk membuat larutan pengencer 1,25 ml larutan stok diencerkan dengan air suling sampai volume 1000 ml, kemudian dimasukkan ke dalam botol pengencer sebanyak 450 ml dan ke dalam tabung reaksi sebanyak 9 ml dan disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.
Homogenisasi contoh:
(a) Timbang 50 g contoh secara aseptik ke dalam botol pengencer yang telah berisi 450 ml larutan pengencer steril sehingga diperoleh pengenceran 1:10, dan
(b) Kocok campuran beberapa kali sehingga homogen.
(2) Angka lempeng total (35oC, 48 jam)
Prinsip
Pertumbuhan bakteri mesofil aerob setelah contoh diinkubasikan dalam pembenihan yang sesuai selama 48 jam pada suhu (35 ± 1) °C.
Peralatan:
(a) Inkubator (35+ 1)oC terkalibrasi;
(b) Oven/alat sterilisasi kering terkalibrasi.
(c) Otoklaf;
(d) Penangas air bersikulasi (45+)oC
(e) Alat penghitung koloni ;
(f) Tally register;
(g) Botol pengencer 160 mL, terbuat dari gelas borosilikat, dengan sumbat karet atau tutup ulir plastik;
(h) Pipet ukur 1 mL steril dengan skala 0,1 mL dilengkapi bulb atau pipettor; dan
(i) Cawan petri gelas/plastik steril (berukuran minimal 15 mm x 90 mm).
Pembenihan dan pengencer:
Plate count agar (PCA)
(1) Tryptone 5 g
(2) Yeast extract 2,5 g
(3) Glukosa 1 g
(4) Agar 15 g
(5) air suling 1000 ml
Larutkan bahan-bahan diatas menjadi 1000 ml dengan air suling dan atur pH menjadi 7,0. Masukkan ke dalam botol. Sterilkan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
Cara kerja:
(a) Buat tingkat pengenceran sesuai kebutuhan seperti pada Gambar 1. dengan menggunakan larutan pengencer Butterfield’s Phosphate-Buffered Dilution Water (BPB);
Gambar 1. Tingkat pengenceran menggunakan larutan pengencer Butterfield’sPhosphate-Buffered Dilution Water (BPB)
(b) Pipet masing-masing 1 ml dari tingkat pengenceran (F) 10-1 sampai dengan 10-4 ke dalam cawan petri steril secara duplo,
(c) Tuangkan 12 ml sampai dengan 15 ml media PCA yang masih cair dengan suhu (45 ± 1)°C ke dalam masing-masing cawan petri,
(d) Goyangkan cawan petri dengan hati-hati (putar dan goyang ke depan, ke belakang, ke kanan dan ke kiri) sehingga contoh dan pembenihan tercampur merata dan memadat;
(e) Kerjakan pemeriksaan blanko dengan mencampur air pengencer untuk setiap contoh yang diperiksa,
(f) Biarkan sampai campuran dalam cawan petri memadat,
(g) Masukkan semua cawan petri dengan posisi terbalik ke dalam lemari pengeram pada suhu 35°C selama (48 ± 2) jam, dan
(h) Catat pertumbuhan koloni (n) pada setiap cawan petri yang mengandung 25 koloni sampai dengan 250 koloni setelah 48 jam.
Cara menghitung:
(a) Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25 koloni sampai dengan 250 koloni setiap cawan petri. Hitung semua koloni dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni. Hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per gram;
(b) jika salah satu dari dua cawan petri terdapat jumlah koloni lebih kecil dari 25 koloni atau lebih besar dari 250 koloni, hitung jumlah koloni yang terletak antara 25 koloni sampai dengan 250 koloni dan kalikan dengan faktor pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per gram;
(3) Escherichia coli
Prinsip:
Pertumbuhan Escherichia coli ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung Durham, yang diikuti dengan uji biokimia dan selanjutnya dirujuk pada Tabel APM (Angka Paling Mungkin).
Peralatan:
(a) Inkubator (35 ± 1) °C;
(b) Penangas air tertutup dengan sistem sirkulasi, (45,5 ± 0,2) °C;
(c) Rak untuk tabung reaksi;
(d) Pipet ukur 10 mL dan 1 mL berskala 0,1 mL;
(e) Botol pengencer terbuat dari gelas borosilikat, dengan tutup ulir/plastik;
(f) Tabung reaksi dan tabung Durham;
(g) Cawan petri gelas ukuran 15 mm x 100 mm atau plastik ukuran 15 mm x 90 mm, steril; dan
(h) Jarum ose (inokulasi), dengan diameter dalam kira-kira 3 mm.
Perbenihan pengencer dan pereaksi:
(a) Lauryl sulfate tryptose (LST) broth / Lauryl tryptose (LT) broth;
(b) Brilliant green lactose bile (BGLB) broth 2 %;
(c) Escherichia coli (EC) broth;
(d) Levine’s eosin methylene blue (L-EMB) agar;
(e) Plate count agar (PCA);
(f) Gram stain;
(g) Tryptone (tryptophane) broth;
(h) Pereaksi kovacs’;
(i) Methyl red – voges proskauer (MR – VP) broth;
(j) pereaksi voges proskauer;
(k) Larutan methyl red;
(l) Koser’s citrate broth;
(m) Peptone diluents 0.1 %;
(n) Pereaksi indole;
(o) larutan kalium hidroksida 40 %;
(p) Buffer fields phosfat buffered dilution water;
(q) Larutan alpha naphtol 5 %; dan
(r) Kristal kreatin.
Cara kerja:
APM – Uji pendugaan untuk Escherichia coli:
(a) Lakukan persiapan dan homogenisasi contoh seperti pada 10.1,
(b) Inokulasikan masing-masing 1 ml larutan dari setiap tingkat pengenceran (larutan 10-1, 10-2 dan 10-3) ke dalam tiga tabung Laurryl sulfate tryptose (LST) broth yang didalamnya terdapat tabung durham terbalik. Pegang pipet sedemikian sehingga ujung bawah pipet menempel pada tabung. Biarkan isi pipet mengalir 2 detik sampai dengan 3 detik. Pipet jangan ditiup untuk mengeluarkan isinya,
(c) Masukkan tabung-tabung tersebut ke dalam inkubator pada suhu 35°C selama
(48 ± 2) jam,
(d) Amati tabung-tabung tersebut pada pada jam ke-(24 ± 2). Jika ada tabung yang telah mengandung gas, keruh maka tabung tersebut dinyatakan ”positif”,
(e) Tabung-tabung yang belum mengandung gas dinyatakan “negatif”, lanjutkan inkubasi selama 24 jam,
(f) Catat adanya pembentukan gas setelah inkubasi (48 ± 2) jam, dan nyatakan tabung tersebut “positif”, dan
(g) Lakukan uji penegasan terhadap semua tabung yang positif untuk uji pendugaan.
APM – Uji penegasan untuk Escherichia coli:
(a) Pindahkan satu mata Ose dari setiap tabung LST yang positif ke dalam tabung EC broth yang berlainan,
(b) Inkubasikan tabung-tabung EC tersebut ke dalam penangas air yang bersirkulasi, selama (24 ± 2) jam pada suhu (45,5 ± 0,2) °C, tabung yang telah terbentuk gas dinyatakan “positif”,
(c) Apabila negatif, inkubasikan dan periksa kembali pada jam ke-(48 ± 2). Jika telah terbentuk gas maka tabung tersebut dinyatakan “positif”, dan
(d) Lakukan uji lengkap terhadap semua tabung yang positif untuk uji penegasan.
Uji lengkap untuk Escherichia coli:
(a) Kocok tabung-tabung EC broth yang positif secara hati-hati,
(b) Ambil koloni sebesar satu mata Ose, kemudian digoreskan/ditanamkan pada satu cawan agar L-EMB, sedemikian rupa hingga dihasilkan koloni yang terpisah-pisah dengan jarak minimum 0,5 cm,
(c) Inkubasikan cawan L-EMB tersebut selama 18 jam sampai dengan 24 jam pada suhu (35 ± 1) °C,
(d) periksa cawan-cawan terhadap adanya koloni yang berwarna hijau dengan atau tanpa kilat logam,
(e) Dari tiap cawan L-EMB, pindahkan maksimal 5 koloni yang mencurigakan pada tabung agar miring PCA,
(f) Inkubasikan tabung-tabung agar miring tersebut selama 18 jam sampai dengan 24 jam pada suhu 35 °C dan gunakan untuk uji selanjutnya,
(g) Buatlah pewarnaan Gram dari tiap biakan. E coli adalah gram negatif dan berbentuk batang tak berspora yang harus diuji menggunakan reaksi-reaksi IMVIC seperti dibawah ini serta harus diinokulasikan kembali ke tabung LST broth untuk menegaskan adanya produksi gas,